【中文題目】一個(gè)小核仁RNA(SNORA13)在核糖體生成和衰老中的非經(jīng)典作用研究

【文章題目】A non-canonical role for a small nucleolar RNA in ribosome biogenesis and senescence

【發(fā)表期刊】Cell（影響因子45.5）

【發(fā)表時(shí)間】2024年8月22日

【研究團(tuán)隊(duì)】美國(guó)德克薩斯大學(xué)Joshua T. Mendell團(tuán)隊(duì)

【研究概要】

細(xì)胞衰老是一種由各種應(yīng)激引起的不可逆的細(xì)胞周期停滯狀態(tài)，包括異常的癌基因激活、端粒縮短和DNA損傷。通過(guò)全基因組篩選，研究者發(fā)現(xiàn)了保守的小核仁RNA (snoRNA) SNORA13，它在人類(lèi)細(xì)胞和小鼠的多種衰老形式中是必需的。盡管SNORA13指導(dǎo)核糖體解碼中心保守核苷酸的假尿苷化，但失去這種snoRNA對(duì)翻譯的影響很小。然而，SNORA13能夠負(fù)調(diào)控核糖體生成。誘導(dǎo)衰老的應(yīng)激會(huì)擾亂核糖體生成，導(dǎo)致游離核糖體蛋白的積累，從而激活衰老細(xì)胞中的p53。因此，SNORA13通過(guò)非典型的分子機(jī)制調(diào)節(jié)核糖體生成和p53通路，這種機(jī)制與其指導(dǎo)RNA修飾的作用不同。這些發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展了我們對(duì)snoRNA功能及其在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中作用的理解。

【主要實(shí)驗(yàn)】

CRISPRi篩選、RNA熒光原位雜交(FISH)、嘌呤霉素?fù)饺雽?shí)驗(yàn)、核糖體分析(Ribo-seq、Polysome profiling)、RNA-seq、ChIP實(shí)驗(yàn)、質(zhì)譜分析、UV-RIP實(shí)驗(yàn)、突變體構(gòu)建、小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

【研究背景】

在非轉(zhuǎn)化細(xì)胞中，由異常的癌基因激活導(dǎo)致的不可逆的細(xì)胞周期停滯狀態(tài)，稱(chēng)為癌基因誘導(dǎo)的衰老 (OIS)。雖然已經(jīng)確定了大量參與衰老程序的編碼基因，但非編碼RNA在細(xì)胞衰老中的作用仍然知之甚少。一類(lèi)與衰老相關(guān)的非編碼RNA—小核仁RNA (snoRNA)，傳統(tǒng)上snoRNA通常可以引導(dǎo)其他RNA化學(xué)修飾。大多數(shù)snoRNA在編碼或非編碼轉(zhuǎn)錄本的內(nèi)含子中編碼，在剪接過(guò)程中切除宿主內(nèi)含子后，被加工成60-300個(gè)核苷酸的成熟形式。除了可以引導(dǎo)RNA修飾，snoRNA還執(zhí)行各種其他功能，包括調(diào)節(jié)前mRNA剪接和通過(guò)類(lèi)似miRNA的機(jī)制調(diào)節(jié)靶mRNA。

【研究結(jié)果】

首先，該研究通過(guò)CRISPRi技術(shù)篩選到了一個(gè)OIS相關(guān)的非編碼RNA—EPB41L4A-AS1，它是一個(gè)高度保守的H/ACA盒snoRNA SNORA13的宿主轉(zhuǎn)錄本。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，敲低EPB41L4A-AS1阻止了HRAS^G12V誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老，使細(xì)胞持續(xù)增殖，表明EPB41L4A-AS1和其編碼的SNORA13在OIS中至關(guān)重要。隨后，利用CRISPR技術(shù)對(duì)SNORA13進(jìn)行敲除，但保證剪接后的EPB41L4A-AS1轉(zhuǎn)錄本正常表達(dá)。進(jìn)一步通過(guò)致癌基因誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)、回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)、DNA損傷處理實(shí)驗(yàn)，證明了SNORA13是多種形式衰老所必需的，而非剪接后的EPB41L4A-AS1轉(zhuǎn)錄本。

圖1. 鑒定了一個(gè)OIS相關(guān)的非編碼RNA—EPB41L4A-AS1，其編碼SNORA13

接下來(lái)，深入研究了SNORA13參與衰老的分子機(jī)制。細(xì)胞分離和FISH實(shí)驗(yàn)證明，SNORA13定位于核仁，且致癌基因誘導(dǎo)后不影響該snoRNA的定位及整體表達(dá)。通過(guò)多種分析證實(shí)了SNORA13是18S.1248U假尿苷化所必需的。由于18S:1248U位點(diǎn)上m¹acp³?修飾在真核生物中是保守的，這種核苷酸修飾定位于核糖體解碼中心，于是推測(cè)SNORA13缺失可能會(huì)影響編碼衰老調(diào)節(jié)因子mRNA的翻譯。隨后，通過(guò)嘌呤霉素?fù)饺雽?shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在正常生長(zhǎng)情況下SNORA13缺失后整體翻譯沒(méi)有明顯變化。不過(guò)，在致癌基因誘導(dǎo)下缺失SNORA13的細(xì)胞中翻譯水平有所增加，但這可能是由于這些細(xì)胞相對(duì)于野生型細(xì)胞持續(xù)增殖的次要后果，因?yàn)?span>p53的缺失也會(huì)導(dǎo)致這些條件下翻譯的增加。

對(duì)野生型和敲除SNORA13的BJ-HRAS^G12V細(xì)胞進(jìn)行Ribo-seq和RNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)在SNORA13敲除的細(xì)胞中，只有少數(shù)轉(zhuǎn)錄本顯示出翻譯效率（TE）的顯著改變。密碼子分析發(fā)現(xiàn)，富含A/U的轉(zhuǎn)錄本TE增加，富含G/C的轉(zhuǎn)錄本TE反而降低，這與之前的研究結(jié)果相似。在正常生長(zhǎng)情況下，SNORA13缺失對(duì)密碼子使用特異性影響極小。以上結(jié)果表明，SNORA13不太可能通過(guò)改變整體翻譯效率、轉(zhuǎn)錄本或密碼子特異性來(lái)調(diào)節(jié)衰老。此外，研究者注意到與之結(jié)果不同的另一項(xiàng)研究，即敲除TSR3后的翻譯及隨后18S rRNA中該位點(diǎn)acp3修飾的缺失，這影響了核糖體蛋白（RP）編碼mRNA的翻譯。這種差異可能是由于隨后添加acp3并不需要該核苷酸的假尿苷化。

圖2. Polysome profiling繪制核糖體圖譜

采用Polysome profiling分析敲除SNORA13的BJ-HRAS^G12V細(xì)胞中核糖體亞基和翻譯核糖體豐度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在SNORA13敲除細(xì)胞中，無(wú)論致癌基因HRAS^G12V激活與否，游離60S亞基和單核糖體80S的穩(wěn)態(tài)豐度均顯著增加。隨后，利用一個(gè)表達(dá)內(nèi)源性SNAP標(biāo)簽的大核糖體亞基蛋白RPL28的HEK293T細(xì)胞系，監(jiān)測(cè)60S核糖體亞基生成。SNORA13基因缺失會(huì)導(dǎo)致總的及新形成的60S核糖體亞基和80S單核糖體豐度增加。使用EDTA將多核糖體解聚成游離的核糖體亞基，也證實(shí)了SNORA13的缺失會(huì)增加60S亞基的穩(wěn)態(tài)豐度。此外，與野生型相比，在敲除SNORA13的細(xì)胞中新標(biāo)記的RPL28會(huì)更快從核仁中消失，即更快組裝成60S并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中。總之，SNORA13參與了細(xì)胞在生理?xiàng)l件下對(duì)核糖體生成的調(diào)控，并在營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)抑制核糖體的生成。因此，SNORA13是核糖體生成的一個(gè)強(qiáng)負(fù)調(diào)控因子。

圖3. SNORA13通過(guò)核仁應(yīng)激反應(yīng)途徑調(diào)節(jié)p53的活性

通過(guò)基因集富集分析（GSEA）分析發(fā)現(xiàn)，在SNORA13敲除細(xì)胞中p53通路活性下降。在致癌基因誘導(dǎo)后，大量的p53蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，且p53與靶基因CDKN1A啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合顯著減少。SNORA13敲除還會(huì)導(dǎo)致MDM2蛋白活性增強(qiáng)，從而抑制p53的核積累和轉(zhuǎn)錄激活活性。而癌基因誘導(dǎo)的核仁應(yīng)激反應(yīng)，可以通過(guò)游離的RP與MDM2結(jié)合來(lái)抑制MDM2活性。敲除SNORA13后，由于60S亞基生成加速，游離RP減少，導(dǎo)致MDM2對(duì)p53的抑制作用增強(qiáng)，最終阻礙了細(xì)胞衰老。這些結(jié)果表明，SNORA13通過(guò)核仁應(yīng)激反應(yīng)途徑調(diào)節(jié)p53的活性。

之后，研究者構(gòu)建了SNORA13的突變體，發(fā)現(xiàn)SNORA13突變后喪失了引導(dǎo)假尿苷化修飾，但仍能與RPL23結(jié)合，而且突變體可以恢復(fù)SNORA13敲除導(dǎo)致的細(xì)胞衰老表型。此外，與敲除SNORA13基因相反，敲除EMG1和TSR3（分別催化18S:1248U的N1甲基化和acp的添加）后，當(dāng)HRAS^G12V表達(dá)激活下進(jìn)入細(xì)胞衰老。以上結(jié)果說(shuō)明，SNORA13通過(guò)一種不同于引導(dǎo)假核苷化的非典型機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)核糖體的生成和衰老。

圖4. SNORA13直接與核糖體蛋白RPL23相互作用，抑制RPL23：28S rRNA相互作用

利用反義寡核苷酸（ASOs）從紫外交聯(lián)的細(xì)胞中分離內(nèi)源性SNORA13核糖核蛋白復(fù)合物（RNP）做質(zhì)譜分析，鑒定到幾種顯著富集的互作蛋白，其中包括大核糖體亞基組分RPL23。UV-RIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了SNORA13與RPL23的特異性結(jié)合。同樣地，使用ASOs從紫外交聯(lián)細(xì)胞中下拉出內(nèi)源性SNORA13，證明了RPL23的特異性共純化。這些結(jié)果表明，SNORA13直接與RPL23相互作用，并且這種相互作用發(fā)生在核糖體亞基組裝完成前。體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，重組RPL23可以與SNORA13形成復(fù)合物，但不能與SNORA25形成復(fù)合物。因此，SNORA13直接與RPL23相互作用，抑制RPL23：28S rRNA相互作用。基于以上結(jié)果，研究者提出SNORA13通過(guò)抑制RPL23整合到正在成熟的60S亞基中來(lái)負(fù)向調(diào)控核糖體生成，從而增強(qiáng)致癌基因誘導(dǎo)的核仁應(yīng)激反應(yīng)。

最后，在小鼠中鑒定到了三個(gè)SNORA13的同源基因，且僅在同時(shí)敲除三個(gè)同源基因后才會(huì)導(dǎo)致60S亞基增加，這與人類(lèi)細(xì)胞中的表型一致。這表明小鼠SNORA13同源基因功能冗余，共同調(diào)控60S亞基生成。之后，利用OIS小鼠模型，進(jìn)一步證明了SNORA13對(duì)體內(nèi)OIS過(guò)程至關(guān)重要，且其在調(diào)控衰老的作用在人類(lèi)和小鼠中保守。

【Polysome Profiling技術(shù)介紹】

基因表達(dá)在多個(gè)層面上受到調(diào)控，包括：表觀遺傳水平調(diào)控、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、翻譯水平調(diào)控以及翻譯后修飾調(diào)控。其中，翻譯調(diào)控控制著蛋白質(zhì)的生物合成以響應(yīng)生理和病理的變化。而且，翻譯水平的調(diào)控也深刻影響了蛋白質(zhì)的豐度。

研究翻譯水平的調(diào)控機(jī)制，有助于深入理解基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，并且可以解釋轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組分析之間的差異。多聚核糖體分析（Polysome profiling）是研究翻譯調(diào)控機(jī)制常用的技術(shù)。Polysome profiling基于蔗糖梯度分離出free mRNA、40S核糖體亞基、60S核糖體亞基、80S monosome以及Polysome等組分。

Polysome profiling可用于特定mRNA的目標(biāo)分析以及翻譯整體分析。此外，也可以獲取正在翻譯的全長(zhǎng)mRNA，包括非翻譯區(qū)（UTR）。UTR含有選擇性翻譯的順式作用元件。鑒定UTR中調(diào)控翻譯的順式作用元件，對(duì)于解析基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制至關(guān)重要。此外，Polysome profiling可以與免疫印跡或蛋白質(zhì)組學(xué)聯(lián)合使用，用于鑒定與核糖體結(jié)合或者與翻譯起始相關(guān)的蛋白質(zhì)。最后，Polysome profiling特別適合于尚未進(jìn)行全基因測(cè)序或者遺傳轉(zhuǎn)化操作困難的物種。

【參考文獻(xiàn)】

Chassé H, Boulben S, Costache V, Cormier P, Morales J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Res. 2017, 45(3):e15. doi: 10.1093/nar/gkw907.

Cheng Y, Wang S, Zhang H, Lee JS, Ni C, Guo J, Chen E, Wang S, Acharya A, Chang TC, Buszczak M, Zhu H, Mendell JT. A non-canonical role for a small nucleolar RNA in ribosome biogenesis and senescence. Cell. 2024, 187(17):4770-4789.e23. doi: 10.1016/j.cell.2024.06.019.